近期，由上海市農科院生物所農業生物安全評價研究卓越團隊和瑞金醫院血管外科合作研發的首例基因編輯豬——“馬凡豬”順利從湖北豬場運抵上海，有望推動相關醫療器械、藥物和手術技術的研發，使我國近百萬馬凡氏綜合征及其他主動脈疾病患者受益。
4種基因編輯方案用於建構馬凡豬模型
馬凡氏綜合征（Marfan syndrome，簡稱MFS）是一種常染色體顯性遺傳疾病，由半個世紀前發現的主要致病基因發生突變引起，因累及骨骼可使手指細長呈蜘蛛指（趾）樣，故又被稱為“蜘蛛指（趾）綜合征”（Arachnodactyly Syndrome）。1896年，法國兒科醫師安東甯·馬凡首次描述了該病以骨骼、眼及心血管三大系統的缺陷為代表的主要特徵，疾病也由此得名。歷史上，俄羅斯鋼琴演奏家謝爾蓋·拉赫瑪尼諾夫、義大利小提琴手尼柯洛·帕格尼尼、美國女子排球運動員海曼等一些在音樂和體育領域取得非凡成就的名人罹患此病，則使該病又有了“天才病”的別稱。除了涉及心血管系統、骨骼系統和眼部等結締組織臨床表型的異常，MFS也涉及基因突變及其編碼的蛋白功能異常。目前已發現的MFS致病性基因突變有700多種，患病率為1/5000-1/10000。患者通常表現為無症狀升主動脈瘤、主動脈夾層、眼晶狀體脫位和以長骨過度生長為特徵的骨骼異常。其中，對患者生命構成最大威脅的是無症狀升主動脈瘤，以及未經治療的升主動脈瘤可能進展為危及生命的急性主動脈夾層，急性期死亡率達到20%-60%。據保守估計，我國目前約有100萬馬凡氏綜合征患者。如果算上其他一些基因突變引起的主動脈疾病，則有望受益的患病人群更大。
通過瑞金醫院提供的臨床病例，上海市農科院科研團隊預測了豬的同源基因發生主動脈病變的區域，有針對性地設計了4種基因編輯方案，使豬的基因發生不同嚴重程度的致病突變。合作團隊將通過評估每頭基因編輯豬的主動脈病變情況，篩選編輯位元點準確的最佳馬凡豬模型，用於推進疾病研究。
模型將用於相關醫療器械開發、藥物研製和驗證
心血管疾病是全球主要致死病因之一。升主動脈瘤作為一種在沒發病的時候沒有症狀，一旦發病就會產生夾層或者破裂進而導致猝死的高危疾病，對其病理機制和治療方法的研究高度依賴動物模型。豬的心血管系統與人類高度相似，因此常被選作疾病模型，尤其是用於主動脈瘤研究。目前，全球心血管器械研發投入不斷增加，如主動脈支架、人工瓣膜等很多新型腔內醫療器械需要在臨床應用前進行安全性和有效性驗證，缺乏主動脈病變的大動物模型成為研發和應用的瓶頸。此外，經導管主動脈瓣置換術等微創手術技術也需通過動物模型進一步驗證安全性和有效性。“馬凡豬”模型的建立，可以用於主動脈病變的手術培訓、藥物研發、主動脈介入醫療器械的驗證等。
“引發豬的主動脈瘤和主動脈夾層的原因不只是馬凡氏綜合征，我們想做的事是用馬凡氏綜合征的主效基因在豬身上構造一個主動脈瘤，或者說主動脈擴張的通用模型，由此進行相關醫療器械開發、藥物研製和驗證。”上海市農科院生物所研究員吳瀟告訴記者，基於基因編輯技術目前已經成熟，這項工作的關鍵難點是選擇編輯位點。主效基因很龐大，有65個外顯子，所以不可能把整個基因都編輯了，那樣的話，豬可能根本就存活不了。科研人員需要選擇編輯這個主效基因的某些區域、確定去掉哪些部分後豬不會死且還能出現理想的症狀。當時上海市農科院團隊考慮了很多因素，通過用軟體分析豬的基因組序列、蛋白組序列，根據蛋白裡決定蛋白功能的結構域分析蛋白的結構，使蛋白既能保留一部分功能繼續存在，又在某些結構上發生變化，失去某些功能。此外，他們也比較了人的基因組和豬的基因組，最終確定了實驗方案，確保豬能夠作為實驗動物活到其主動脈發生病變的時刻。這個馬凡氏綜合征模型豬在國內是首例。目前看來，無症狀升主動脈瘤在馬凡豬身上已經產生，主動脈夾層還沒有發現。
“因為豬自然交配的成本比克隆豬低很多，而產生的幼豬的成活率比克隆豬高很多，我希望能夠培育一個豬的家系，有固定的母本和固定的父本，它們能夠通過自然交配生產出符合要求的模型豬。這樣，成本是比較低的。另外，如何建家系本身也是一個研究課題。”吳瀟說。
從基因編輯小鼠到基因編輯豬：動物模型的進階之路
上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院普外科-血管外科主任馮家烜教授是上海市農科院團隊開展這項研究的合作夥伴。此前，馮家烜教授曾與中國科學院研究人員合作在發生了基因突變的小鼠身上進行基因編輯，探索馬凡氏綜合征的病理建模。當時那些小鼠主要被用於研究骨骼和晶狀體方面的基因突變問題，還沒有關於其主動脈表型的分析。馮家烜與合作夥伴觀察小鼠後發現，當它們長到約10個月大的時候，會自發出現許多主動脈表型，甚至發生主動脈破裂導致的死亡。但這一方面需要經過較長的時間；另一方面，表型率比較低，僅百分之三四十左右。研究人員經過探索，得到了誘導馬凡氏綜合征小鼠主動脈瘤表型所需的關鍵因素——血管緊張素的最佳添加劑量，也探索了給藥方式，發現局部給藥和從靜脈給藥，對小鼠主動脈的感染效率完全不一樣。從靜脈給藥，99%以上的藥物都回流到了肝臟，能夠感染主動脈的很少；而局部給藥的干預強度對於藥物劑量的需求就非常小，藥物對全身的干預相應也小。此外，馮家烜還與合作夥伴嘗試了一種名為“CRISPR Activation”（CRISPR A）的基因修復方法，主要通過啟動等位基因的正常鏈，由正常鏈的表達代償異常鏈表達的不足，從中發現這種基因修復方法能夠降低小鼠主動脈瘤的發生和死亡率。
但由於小鼠與人在體型上的巨大差異，在小鼠身上得到驗證的基因編輯效應雖然很容易發表論文，要實現臨床轉化卻不太可能。原因之一是基因編輯小鼠的心率、血壓、血流動力學都與人這個大動物不一樣，在小鼠身上能夠發揮的基因修復效應，在人的血流動力學環境下是否能實現同等發揮，還是個問號；其次，基因編輯藥物能夠在人身上發揮作用的干預劑量需要在接近人體血流動力學的環境中進行試驗，體型與人相差懸殊的小鼠顯然不能勝任這個使命，而這次馮家烜與上海市農科院研究團隊的合作實驗選用的體重80斤左右的豬的無疑要理想得多。
首批基因編輯豬已達到理想建模要求
據馮家烜教授介紹，沒有疾病模型時，醫生們做實驗和熟悉操作流程都在正常的豬身上進行。這比之使用馬凡豬進行操作，就如同在岩石裡面打樁和在稀鬆的泥巴地裡打樁的區別——會在岩石裡面打樁的人不一定會在泥巴地裡打樁。如果拿正常的豬做實驗，就好比是在岩石內部打樁，無論是縫的針還是放的支架，感覺好像都很牢固，但真到發生病變的動物或人的身體裡開刀或放支架，定位的位置，包括支架尺寸的選擇，可能都是完全不一樣的。
“因此，無論是在研發器具還是在推廣器具、對醫務人員進行培訓的過程中，帶有突變主效基因的馬凡豬模型對於醫生類比在臨床操作中的手感、整個操作流程和可能遇到的各種真實情況，都非常有説明。如果我們要為一位由馬凡氏綜合徵引起主動脈瓣反流的患者研發一個能夠治療他（她）的帶瓣支架，我們就需要有馬凡豬這樣的動物模型。”馮家烜向記者表示。據他所知，現在每年新發的主動脈夾層患者能夠接觸到手術的大約在30萬例左右，相關報導顯示，這30萬例中有60%屬於由遺傳因素引起的主動脈夾層。
記者從上海市農科院獲悉，基於首批基因編輯豬所表現的症狀已經達到理想的建模要求，市農科院研究團隊後續還計畫克隆3批基因編輯豬。